Биочип для сортировки клеток крови – уже реальность

Подробнее об этом мы попросили рассказать кандидата физико-математических наук, ученого секретаря ВШМЭМ Софью Кузнецову.

Софья, в последнем номере журнала «Вопросы гематологии/онкологии и иммунопатологии в педиатрии» вы опубликовали результаты своего скринингового исследования. Расскажите, в чем его новаторство и отличие от ваших предыдущих работ?

Основу диагностики лейкозов составляют два исследования, без которых обойтись невозможно. Это исследование морфологии клеток крови или костного мозга, которое проводится под микроскопом и доступно повсеместно. И так называемое иммунотипирование – определение на поверхности лейкоцитов крови или костного мозга специальных поверхностных маркеров, которые характерны для того или другого типа клеток. Это исследование проводится методом проточной цифометрии, поэтому доступно далеко не везде. Чтобы правильно поставить диагноз, необходимо сопоставить результаты обоих исследований. В противном случае, диагноз будет неполным и неточным.

Поэтому несколько лет назад мы поставили себе задачу: разработать тест, который бы, с одной стороны, можно было сделать в любом месте, где есть морфолог, который исследует мазки под микроскопом. А с другой стороны, который содержал бы в себе, хотя бы частично, информацию, обычно получаемую методом иммунотипирования. В итоге мы разработали то, что мы называем клеточным биочипом. Он представляет собой прозрачную подложку, на которую в определенных местах нанесены антитела к поверхностным антигенам лейкоцитов. Клетки, выделенные из крови или костного мозга, осаждаются на эту подложку, затем те, что не связались, отмываются. После этого мы можем клетки высушить и окрасить, исследовать их морфологию и цитохимию.

Но главное, что в результате этого мы получаем мазок крови или костного мозга, в котором клетки предварительно «рассортированы» по своим поверхностным антигенам. Если потом клетки с патологической морфологией мы можем увидеть глазами, то, определив, на каких из пятен антител эти клетки связались, мы можем получить данные не только о том, что острый лейкоз есть, но и о том, к какой подгруппе лейкоцитов относятся опухолевые клетки.

Таким образом, получается, что мы одновременно исследуем и морфологию, и иммунофенотип опухолевых клеток. Сопоставляя эту информацию в одном и том же образце, фактически, мы можем поставить диагноз.

Особенность нового метода в том, что изначально он разрабатывался для диагностики гематологических нарушений, прежде всего, лейкозов. В частности, для диагностики острых лейкозов у детей. Он позволяет одновременно сортировать клетки по поверхностным маркерам и затем исследовать их морфологию. Но у новорожденных, особенно у недоношенных, очень важно определять соотношения различных лейкоцитов в периферической крови для диагностики врожденных иммунодефицитов и наличие незрелых миелоидных клеток, которые могут свидетельствовать о начале сепсиса. Поскольку обычные методы, которые могут быть для этого использованы либо дорогостоящие, как проточная цитометрия, либо трудоемкие, они, как правило, в скрининге не используются. А наш метод позволяет одновременно на одном и том же образце, во-первых, определить соотношение различных лимфоцитов в крови, а во-вторых, определить наличие незрелых гранулоцитов. Причем, все это довольно быстро. Метод потенциально может быть использован для скрининга.

В работе, которую мы представляем в данном издании, мы, прежде всего, рассказываем о наборе норм у доношенных и недоношенных новорожденных нашим методом. Мы определяли соотношение различных типов лейкоцитов, с одной стороны, и количествонезрелых гранулоцитов – с другой, чтобы знать, в каких пределах эти параметры колеблются у нормальных ребятишек. В дальнейшем мы надеемся получать уже кровь пациентов, у которых наличие сепсиса доказано, чтобы посмотреть, работает ли этот метод в качестве скрининга на неонатальный сепсис.

Проведя новорожденному малышу такой скрининг, возможно лисделать определенные выводы о состоянии его здоровья?

О состоянии здоровья в целом – наверное, нет. Но о наличии в организме значимых нарушений в соотношении различных клеток, то есть врожденного иммунодефицита – я думаю, сможем наверняка. В случае с врожденным сепсисом этот метод тоже многообещающий, потому что в отличие от исследования мазка, где нужно просмотреть очень много клеток, чтобы увидеть среди них незрелые гранулоциты,в нашем методе все они заранее сконцентрированы на одном маленьком участке.Морфолог в микроскоп очень быстро сможет их заметить, посчитать и сказать, что их больше порога, а значит вероятен врожденный сепсис.

О трудозатратах. Вы сказали, что это очень быстрый метод – с момента забора крови у ребенка до готового анализа.

С момента взятия крови до окончательного результата проходит примерно два часа. То есть нам нужно выделить клетки (примерно 30-40 минут), потом мы их держим вместе с биочипом еще 30-40 минут, затем сушим и красим. Далее идет морфологическая работа, в зависимости от того, насколько детальный нужен ответ (30-60 минут). То есть, это не очень сложно, довольно быстро и недорого -не дороже, чем исследование мазка.

Сам биочип – это некий шаблон, на который накладываются анализы ребенка?

Биочип может быть использован для решения двух задач. Во-первых, просто посмотреть на соотношение количества различных типов клеток. Отличие от нормы будет видно невооруженным глазом. Вторая же задача– исследование морфологии клеток, которые предварительно рассортированы. На это уходит существенно больше времени, потому что каждое из пятен нужно исследовать точно также, как это делает морфолог в мазке. Но за счет того, что различные типы клеток сгруппированы в разных местах, если вы интересуетесь чем-нибудь одним, это можно сделать очень быстро, не выискивая нужные Вам клетки по всему стеклу.

Ранее вы говорили, что при внедрении биочипов они, в каком-то смысле, могут выполнять функцию медкарты ребенка. И с некой периодичностью этот анализ можно делать снова, чтобы понять: со здоровьем все в порядке. А как часто можно это делать?

Если биочип использовать как упрощенный способ иммунофенотипирования, он может, в частности, давать часть информации, которая сейчас входит в понятие иммунный статус – соотношение различных лимфоцитов в крови. И есть ряд ситуаций, в которых это необходимо проверять. Например, у нас есть работа с пациентами с инфекционным мононуклеозом. Им оказалось очень полезно этот анализ делать, потому что соотношения различных типов клеток плюс морфология, позволяют отличить инфекционный мононуклеоз, вызванный вирусом Эпштейна-Барр, от других заболеваний с похожей клинической картиной. Но в целом все же разработанный нами анализ довольно неспецифичен, как и общий анализ крови – для большинства заболеваний его результаты либо не изменятся, либо изменятся так, что диагноз на основании только этих изменений поставить нельзя.

То есть, дает повод насторожиться, но не может ничего диагностировать с точностью?

Конечно, есть ситуации, в которых он, и правда, позволяет поставить диагноз – это прежде всего лейкозы. Мы сейчас разработали диагностическую схему – что нужно делать, на что смотреть, что можно посчитать, чтобы фактически диагностироватьлейкоз – и не просто лейкоз, а конкретный подвид лейкоза, диагноз, который в случае необходимости позволит назначить лечение.

В общемировой практике метод, который вы используете, уже внедряется?

В мировой практике он не внедрен -прежде всего, из-за повсеместной доступности проточной цитометрии. Есть ситуации, в которых возможно использование биочипа в качестве промежуточной диагностики –между ситуацией, когда с человеком что-то не то и у него подозревают гематологическое нарушение, имоментом, когда его направляют в специализированное медицинское учреждение заподтверждением диагноза. Это касается тех стран, где, как и у нас, очень большой разброс между возможностями в центре и на периферии. Если страна большая, то есть смысл делать промежуточный анализ вроде нашего – на месте, чтобы подтвердить необходимость скорейшего обращения пациента в специализированное учреждение. Поэтому хотяза границей данный анализ пока не используется,мы надеемся,что в будущем он сможет применяться в больших странах– в Индии, Бразилии и др. В Европе же это нецелесообразно.

Есть так называемый «пяточный тест» для новорожденных. А если к нему добавить то, что предлагаете вы?

В принципе, единственное препятствие в том, нам потребуется немного больше крови. Буквально на один-два миллилитра. Но в тех ситуациях, когда есть реальный риск (у недоношенных, малышей с иммунодефицитом, когда есть риск сепсиса), это оправданно. Кроме того, наш тест можно оптимизировать так, чтобы еще уменьшить объем забираемой крови.

Пока это пилотная работа. А какие дальнейшие пути ее развития вы предполагаете? Что в планах?

Мы хотели бы прежде всего поговорить, с врачами: считают ли они целесообразным проведение такого скрининга. Потому что пока это лишь открытие. Если есть целесообразность, то мы, конечно, попробуем это сделать. Сепсис новорожденных случается намного чаще, чем врожденные иммунодефициты. Поэтому мы планируем прежде всего поговорить с врачами в отделениях, где лежат сильно недоношенные дети с высоким риском развития сепсиса, чтобы продолжить эту работу узкопрофильно.

Правильно ли я понимаю, что именно этот метод позволит с минимальными затратами выявить и предотвратить наличие сепсиса у детей недоношенных?

Именно так. Потому что появление незрелых клеток можно «поймать» раньше, чем разовьется сильное клиническое проявление сепсиса. И чтобы избежать летального исхода, чрезвычайно важно знать как можно раньше, когда начинается сепсис. Своевременное применение антибиотиков позволяет не допустить трагедии. Ведь ранний сепсис новорожденного – очень серьезная проблема. Даже если всё пройдет для маленького пациента незаметно сейчас, осложнения могут возникнуть в дальнейшем.

В настоящий момент мы уже показали, что использование такого биочипа для исследования костного мозга позволяет поставить диагноз острого лейкоза вплоть до подгруппы по FAB-классификации. Мы надеемся, что такой анализ будет использоваться на местах в качестве предварительной диагностики. Что он пригодится как промежуточный и быстрый диагностический тест, который позволит сказать, что у пациента есть подозрения на серьезное гематологическое заболевание. И это может быть основанием для быстрой госпитализации или направления на диагностику в специализированное учреждение. Причем, из самых удаленных уголков нашей страны, что очень важно.

Еще одним хорошим свойством этого чипа является то, что он может быть использован для удаленной телемедицинской консультации с морфологом. Если речь идет, например, о мазках крови или костного мозга, на расстоянии это всегда было сложно сделать. А при наличии биочипа вы можете отдельно показать, как выглядят клетки, положительные по определенным маркерам. Это очень сильно упрощает диагностику.

Биочип может быть отправлен по почте – как и мазок, он хранится долго. Кроме того, он пластиковый, не треснет и может храниться до конца жизни человека.

Подробности об исследовании читайте в ближайшем номере журнала «Вопросы гематологии/онкологии и иммунопатологии в педиатрии»